Starověký systém řízený RNA by mohl zjednodušit dodávání genových terapií

Rozsiahle pátrání po přirozené rozmanitosti vedlo vědce z McGovern Institute for Brain Research a Broad Institute of MIT and Harvard k objevu starověkých systémů, které by mohly rozšířit nástroje pro editaci genomu.

Tyto systémy, které vědci nazývají TIGR (Tandem Interspaced Guide RNA) systémy, používají RNA k navádění na specifická místa na DNA. Systémy TIGR lze naprogramovat k cílení na libovolnou DNA sekvenci a mají odlišné funkční moduly, které mohou působit na cílenou DNA. Kromě své modularity je TIGR ve srovnání s jinými RNA-řízenými systémy, jako je CRISPR, velmi kompaktní, což je velká výhoda pro jeho dodávání v terapeutickém kontextu.

Tyto poznatky byly publikovány online 27. února v časopise Science.

„Jedná se o velmi všestranný RNA-řízený systém s mnoha různými funkcemi,“ říká Feng Zhang, profesor neurovědy na MIT, který výzkum vedl. Proteiny spojené s TIGR (Tas), které Zhangův tým objevil, sdílejí charakteristickou RNA-vazebnou složku, která interaguje s RNA průvodcem, který ji směruje na specifické místo v genomu. Některé štěpí DNA na tomto místě pomocí sousedního segmentu proteinu štěpícího DNA. Tato modularita by mohla usnadnit vývoj nástrojů, čímž by se umožnilo výměna užitečných nových funkcí v přírodních Tas proteinech.

„Příroda je úžasná,“ říká Zhang, který je také výzkumníkem v McGovern Institute a Howard Hughes Medical Institute, jádrem Broad Institute, profesorem mozkových a kognitivních věd a biologického inženýrství na MIT a spoluředitelem K. Lisa Yang a Hock E. Tan Center for Molecular Therapeutics na MIT. „Má obrovskou rozmanitost a my jsme zkoumali tuto přirozenou rozmanitost, abychom našli nové biologické mechanismy a využili je pro různé aplikace k manipulaci s biologickými procesy,“ říká. Zhangův tým dříve upravil bakteriální CRISPR systémy do nástrojů pro editaci genů, které transformovaly moderní biologii. Jeho tým také našel řadu programovatelných proteinů, jak z CRISPR systémů, tak i z jiných zdrojů.

Ve své nové práci, aby nalezli nové programovatelné systémy, se tým zaměřil na strukturální rys proteinu CRISPR-Cas9, který se váže na RNA průvodce enzymu. To je klíčový rys, který z Cas9 udělal tak silný nástroj: „Bytí RNA-řízeným zjednodušuje jeho přeprogamování, protože víme, jak se RNA váže na jinou DNA nebo jinou RNA,“ vysvětluje Zhang. Jeho tým prohledal stovky milionů biologických proteinů se známými nebo předpokládanými strukturami a hledal ty, které sdílely podobnou doménu. Aby našli vzdáleněji příbuzné proteiny, použili iterativní proces: z Cas9 identifikovali protein zvaný IS110, o kterém jiní dříve ukázali, že se váže na RNA. Poté se zaměřili na strukturální vlastnosti IS110, které umožňují vazbu RNA, a opakovali svůj průzkum.

V tomto okamžiku průzkum odhalil tolik vzdáleně příbuzných proteinů, že se tým obrátil na umělou inteligenci, aby dal smysl seznamu. „Když provádíte iterativní, hluboké dolování, výsledné zásahy mohou být tak rozmanité, že je obtížné je analyzovat pomocí standardních fylogenetických metod, které se spoléhají na konzervované sekvence,“ vysvětluje Guilhem Faure, výpočetní biolog v Zhangově laboratoři. Pomocí jazykového modelu pro proteiny byl tým schopen seskupit proteiny, které našli, do skupin podle jejich pravděpodobných evolučních vztahů. Jedna skupina se od ostatních odlišovala a její členové byli obzvláště zajímaví, protože byly kódovány geny s pravidelně rozmístěnými repetitivními sekvencemi připomínajícími nezbytnou součást CRISPR systémů. To byly systémy TIGR-Tas.

Zhangův tým objevil více než 20 000 různých Tas proteinů, většinou se vyskytujících ve virech infikujících bakterie. Sekvence v repetitivní oblasti každého genu – jeho pole TIGR – kódují RNA průvodce, který interaguje s RNA-vazebnou částí proteinu. U některých je oblast vazby RNA sousedící s částí proteinu štěpící DNA. Jiné se zdají vázat na jiné proteiny, což naznačuje, že by mohly pomoci směrovat tyto proteiny na DNA cíle.

Zhang a jeho tým experimentovali s desítkami Tas proteinů a prokázali, že některé lze naprogramovat tak, aby prováděly cílené řezy DNA v lidských buňkách. Při přemýšlení o vývoji systémů TIGR-Tas na programovatelné nástroje vědci povzbuzují vlastnosti, které by mohly tyto nástroje učinit obzvláště flexibilními a přesnými.

Uvádějí, že CRISPR systémy lze směrovat pouze na segmenty DNA, které jsou lemovány krátkými motivy známými jako PAM (protospacer adjacent motifs). Proteiny TIGR Tas naopak nemají takový požadavek. „To znamená, že teoreticky by mělo být možné cílit na libovolné místo v genomu,“ říká vědecká poradkyně Rhiannon Macrae. Experimenty týmu také ukazují, že systémy TIGR mají to, co Faure nazývá „duální systém navádění“, který interaguje s oběma vlákny DNA dvojité spirály, aby se zaměřil na své cílové sekvence, což by mělo zajistit, že budou působit pouze tam, kam je směruje jejich RNA průvodce. Navíc jsou Tas proteiny kompaktní – v průměru čtvrtina velikosti Cas9 – což usnadňuje jejich dodávání, což by mohlo překonat hlavní překážku pro terapeutické použití nástrojů pro editaci genů.

Zhangův tým je nadšen svým objevem a nyní zkoumá přirozenou roli systémů TIGR ve virech, stejně jako to, jak je lze přizpůsobit pro výzkum nebo terapii. Určili molekulární strukturu jednoho z Tas proteinů, o kterých zjistili, že fungují v lidských buňkách, a tyto informace použijí k usměrnění svého úsilí o jeho zefektivnění. Kromě toho si všimli souvislostí mezi systémy TIGR-Tas a určitými RNA-zpracovávajícími proteiny v lidských buňkách. „Myslím, že je tam ještě více k prozkoumání, pokud jde o to, jaké některé z těchto vztahů mohou být, a může nám to pomoci lépe porozumět tomu, jak se tyto systémy používají u lidí,“ říká Zhang.

Tato práce byla podpořena Helen Hay Whitney Foundation, Howard Hughes Medical Institute, K. Lisa Yang and Hock E. Tan Center for Molecular Therapeutics, Broad Institute Programmable Therapeutics Gift Donors, Pershing Square Foundation, William Ackman, Neri Oxman, rodinou Phillips, J. a P. Poitras a BT Charitable Foundation.