Inženýři MIT přeměňují kožní buňky přímo na neurony pro buněčnou terapii

Přeměna jednoho typu buňky na jiný, například kožní buňky na neuron, se dosud prováděla procesem, který vyžadoval indukci kožní buňky do „pluripotentní“ kmenové buňky a následnou diferenciaci na neuron. Vědci z MIT nyní vyvinuli zjednodušený proces, který fázi kmenových buněk obchází a přeměňuje kožní buňku přímo na neuron.

Při práci s myšími buňkami výzkumníci vyvinuli konverzní metodu, která je vysoce účinná a dokáže z jedné kožní buňky vytvořit více než 10 neuronů. Pokud by se tento přístup zopakoval u lidských buněk, umožnil by to generování velkého množství motorických neuronů, které by se potenciálně mohly použít k léčbě pacientů s poraněním míchy nebo nemocemi, které poškozují pohyblivost.

„Dosáhli jsme výnosů, které nám umožnily klást otázky o tom, zda by tyto buňky mohly být životaschopnými kandidáty na buněčné náhradní terapie, což doufáme, že by mohly být. To je místo, kam nás mohou tyto typy technologií přeprogramování dovést,“ říká Katie Gallowayová, profesorka biomedicínského inženýrství a chemického inženýrství.

Jako první krok k vývoji těchto buněk jako terapie vědci ukázali, že mohou generovat motorické neurony a implantovat je do mozku myší, kde se integrují s hostitelskou tkání.

Gallowayová je hlavní autorkou dvou článků popisujících novou metodu, které dnes vycházejí v časopise Cell Systems. Hlavním autorem obou článků je postgraduální student MIT Nathan Wang.

Od kůže k neuronům

Před téměř 20 lety vědci v Japonsku ukázali, že dodáním čtyř transkripčních faktorů do kožních buněk je mohou přimět k tomu, aby se staly indukovanými pluripotentními kmenovými buňkami (iPSC). Podobně jako embryonální kmenové buňky, i iPSC se mohou diferencovat na mnoho dalších typů buněk. Tato technika funguje dobře, ale trvá několik týdnů a mnoho buněk nakonec nedosáhne úplného přechodu na zralé typy buněk.

„Jednou z výzev při přeprogramování je často to, že buňky mohou uvíznout v mezistupních stavech,“ říká Gallowayová. „Používáme tedy přímou konverzi, kdy místo abychom procházeli meziproduktem iPSC, jdeme přímo ze somatické buňky na motorický neuron.“

Výzkumná skupina Gallowayové a další již dříve prokázali tento typ přímé konverze, ale s velmi nízkými výnosy – méně než 1 procento. V předchozí práci Gallowayové použila kombinaci šesti transkripčních faktorů plus dvou dalších proteinů, které stimulují proliferaci buněk. Každý z těchto osmi genů byl dodáván pomocí samostatného virového vektoru, což ztěžovalo zajištění správné exprese každého genu v každé buňce.

V prvním z nových článků v Cell Systems Gallowayová a její studenti popsali způsob, jak tento proces zjednodušit, takže kožní buňky lze přeměnit na motorické neurony pomocí pouhých tří transkripčních faktorů plus dvou genů, které pohánějí buňky do vysoce proliferativního stavu.

Pomocí myších buněk výzkumníci začali s původními šesti transkripčními faktory a experimentovali s jejich postupným vyřazováním, dokud nedosáhli kombinace tří – NGN2, ISL1 a LHX3 – které mohly úspěšně dokončit konverzi na neurony.

Jakmile se počet genů snížil na tři, výzkumníci mohli použít jeden modifikovaný virus k dodání všech tří, čímž zajistili, že každá buňka exprimuje každý gen na správných úrovních.

Pomocí samostatného viru vědci také dodávali geny kódující p53DD a mutovanou verzi HRAS. Tyto geny nutí kožní buňky k mnohonásobnému dělení předtím, než začnou konvertovat na neurony, což umožňuje mnohem vyšší výnos neuronů, přibližně 1 100 procent.

„Pokud byste exprimovali transkripční faktory na skutečně vysokých úrovních v neproliferativních buňkách, míra přeprogramování by byla velmi nízká, ale hyperproliferativní buňky jsou vnímavější. Je to, jako by byly připraveny na konverzi a pak se stanou mnohem vnímavějšími k úrovním transkripčních faktorů,“ říká Gallowayová.

Výzkumníci také vyvinuli mírně odlišnou kombinaci transkripčních faktorů, která jim umožnila provést stejnou přímou konverzi pomocí lidských buněk, ale s nižší efektivitou – mezi 10 a 30 procenty, odhadují výzkumníci. Tento proces trvá asi pět týdnů, což je o něco rychlejší než nejprve přeměnit buňky na iPSC a pak je přeměnit na neurony.

Implantace buněk

Jakmile výzkumníci identifikovali optimální kombinaci genů k dodání, začali pracovat na nejlepších způsobech jejich dodání, což bylo zaměření druhého článku v Cell Systems.

Vyzkoušeli tři různé dodávací viry a zjistili, že retrovirus dosáhl nejúčinnější míry konverze. Snížení hustoty buněk pěstovaných v misce také pomohlo zlepšit celkový výnos motorických neuronů. Tento optimalizovaný proces, který trvá asi dva týdny u myších buněk, dosáhl výnosu více než 1 000 procent.

Ve spolupráci s kolegy z Bostonské univerzity výzkumníci poté otestovali, zda tyto motorické neurony lze úspěšně implantovat do myší. Dodali buňky do části mozku známé jako striatum, která se podílí na řízení pohybu a dalších funkcích.

Po dvou týdnech výzkumníci zjistili, že mnoho neuronů přežilo a zdálo se, že vytváří spojení s dalšími mozkovými buňkami. Při pěstování v misce tyto buňky vykazovaly měřitelnou elektrickou aktivitu a signály vápníku, což naznačuje schopnost komunikovat s dalšími neurony. Výzkumníci nyní doufají, že prozkoumají možnost implantovat tyto neurony do míchy.

Tým z MIT také doufá, že zvýší účinnost tohoto procesu pro konverzi lidských buněk, což by mohlo umožnit generování velkého množství neuronů, které by se mohly použít k léčbě poranění míchy nebo onemocnění, která ovlivňují kontrolu pohybu, jako je ALS. Klinické studie s použitím neuronů odvozených z iPSC k léčbě ALS jsou nyní v běhu, ale rozšíření počtu buněk dostupných pro takové léčby by mohlo usnadnit jejich testování a vývoj pro širší použití u lidí, říká Gallowayová.

Výzkum byl financován Národním institutem pro obecné lékařské vědy a programem postgraduálních stipendií Národní vědecké nadace.